Hvala vam što ste posjetili www.chinacdoe.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Lab-on-a-chip sistemi sa mogućnostima na licu mesta nude potencijal za brzu i tačnu dijagnozu i korisni su u okruženjima sa ograničenim resursima gde biomedicinska oprema i obučeni stručnjaci nisu dostupni.Međutim, stvaranje sistema za testiranje na licu mjesta koji istovremeno ima sve potrebne karakteristike za multifunkcionalno doziranje, oslobađanje na zahtjev, pouzdane performanse i dugotrajno skladištenje reagensa ostaje veliki izazov.Ovdje opisujemo tehnologiju mikro-putnog prekidača pokretanog polugom koja može manipulirati tekućinama u bilo kojem smjeru, pružiti precizan i proporcionalan odgovor na primijenjeni pritisak zraka i ostati stabilan protiv naglih pokreta i vibracija.Na osnovu tehnologije, opisujemo i razvoj sistema lančane reakcije polimeraze koji integriše funkcije uvođenja reagensa, miješanja i reakcije u jednom procesu, čime se postiže performansa „uzorak-u-odgovor“ za sve kliničke nazalne uzorke od 18 pacijenata sa Influenca i 18 pojedinačnih kontrola, u dobroj saglasnosti intenziteta fluorescencije sa standardnom lančanom reakcijom polimeraze (Pearsonovi koeficijenti > 0,9).Zasnovano na tehnologiji, opisujemo i razvoj sistema lančane reakcije polimeraze koji integrira funkcije uvođenja reagensa, miješanja i reakcije u jednom procesu, čime se postiže performansa "uzorak-u-odgovor" za sve kliničke nazalne uzorke od 18 pacijenata. sa Influencom i 18 pojedinačnih kontrola, u dobroj saglasnosti intenziteta fluorescencije sa standardnom lančanom reakcijom polimeraze (Pearsonovi koeficijenti > 0,9).Osnovavajući se na ovoj tehnologiji, mi također opisujemo razradu sistema polimeraznoj cepnoj reakciji, koja objedinjuje funkcije uvođenja reagensa, miješanja i reakcije u jednom procesu, što osigurava ispunjavanje «obrazac-v-otvet-vyhod» za sve kliničke edukatore iz nosa 18 pacijenata s Grippom i 18 odvojenih kontrola, u dobrom skladu sa intenzitetom fluorescencije sa standardnom polimeraznom cepnom reakcijom (koeficijent Pirsona> 0,9).Na osnovu ove tehnologije, opisujemo i razvoj sistema lančane reakcije polimeraze koji kombinuje funkcije ubrizgavanja, miješanja i reakcije u jednom procesu, omogućavajući uzorak u odgovoru za sve kliničke nazalne uzorke od 18 pacijenata oboljelih od gripe.i 18 pojedinačnih kontrola, u dobroj saglasnosti sa standardnim intenzitetom fluorescencije polimerazne lančane reakcije (Pearsonovi koeficijenti > 0,9).Na osnovu ove tehnologije, opisujemo i razvoj sistema lančane reakcije polimeraze koji integrira funkcije ubrizgavanja reagensa, miješanja i reakcije za analizu svih kliničkih nazalnih uzoraka iz 18 uzoraka nosa pacijenata u uzorku. Gripa i 18 pojedinačnih kontrola, intenzitet fluorescencije usklađen bunar sa standardnom lančanom reakcijom polimeraze (Pearsonov koeficijent > 0,9).Predložena platforma jamči pouzdanu automatizaciju biomedicinske analize i na taj način može ubrzati komercijalizaciju niza uređaja za testiranje na licu mjesta.
Nove ljudske bolesti, kao što je pandemija COVID-19 2020. koja je odnijela živote miliona ljudi, predstavljaju ozbiljnu prijetnju globalnom zdravlju i ljudskoj civilizaciji1.Rano, brzo i precizno otkrivanje bolesti ključno je za kontrolu širenja virusa i poboljšanje ishoda liječenja.Osnovni dijagnostički ekosistem zasnovan na centralizovanim laboratorijama u kojima se uzorci za testiranje šalju u bolnice ili dijagnostičke klinike i vode ih profesionalci trenutno ograničava pristup za skoro 5,8 milijardi ljudi širom sveta, posebno onih koji žive u okruženjima sa ograničenim resursima.gdje nedostaje skupa biomedicinska oprema i kvalifikovani stručnjaci.kliničari 2. Stoga, postoji hitna potreba za razvojem jeftinog i jednostavnog sistema laboratorije na čipu sa mogućnošću testiranja na mjestu pružanja njege (POCT) koji može pružiti kliničarima pravovremene dijagnostičke informacije za donošenje informiranih odluka o dijagnozi .i tretman 3.
Smjernice Svjetske zdravstvene organizacije (WHO) navode da bi idealni POCT trebao biti pristupačan, jednostavan za korištenje (jednostavan za korištenje uz minimalnu obuku), precizan (izbjegavajte lažne negativne ili lažne pozitivne rezultate), brz i pouzdan (omogućava dobra svojstva ponovljivosti) i isporučivo (sposobno za dugotrajno skladištenje i lako dostupno krajnjim korisnicima)4.Da bi ispunili ove zahtjeve, POCT sistemi moraju obezbijediti sljedeće karakteristike: svestrano doziranje za smanjenje ručne intervencije, oslobađanje na zahtjev za skaliranje transporta reagensa za precizne rezultate testa i pouzdane performanse kako bi izdržale vibracije okoline.Trenutno, najčešće korišteni POCT uređaj je traka za bočni protok5,6 koja se sastoji od nekoliko slojeva poroznih nitroceluloznih membrana koje potiskuju vrlo malu količinu uzorka naprijed, reagirajući s prethodno imobiliziranim reagensima kapilarnom silom.Iako imaju prednost niske cijene, jednostavnosti korištenja i brzih rezultata, POCT uređaji zasnovani na flow trakama mogu se koristiti samo za biološke testove (npr. testovi glukoze7,8 i testovi trudnoće9,10) bez potrebe za višestepenim analizama.reakcije (npr. punjenje više reagensa, miješanje, multipleksiranje).Osim toga, pokretačke sile koje kontroliraju kretanje tekućine (tj. kapilarne sile) ne osiguravaju dobru konzistentnost, posebno između serija, što rezultira lošom ponovljivošću11 i čini trake bočnog protoka prvenstveno korisnim za dobro otkrivanje12,13.
Proširene proizvodne mogućnosti na mikro i nanorazini stvorile su mogućnosti za razvoj mikrofluidnih POCT uređaja za kvantitativna mjerenja14,15,16,17.Podešavanjem svojstava interfejsa 18, 19 i geometrije kanala 20, 21, 22, kapilarna sila i brzina protoka ovih uređaja mogu se kontrolisati.Međutim, njihova pouzdanost, posebno za jako vlažne tekućine, ostaje neprihvatljiva zbog proizvodnih nepreciznosti, nedostataka materijala i osjetljivosti na vibracije okoline.Osim toga, budući da se kapilarni protok stvara na granici tekućina-gas, ne može se uvesti dodatni protok, posebno nakon punjenja mikrofluidnog kanala tekućinom.Stoga, za složeniju detekciju, potrebno je izvršiti nekoliko koraka ubrizgavanja uzorka24,25.
Među mikrofluidnim uređajima, centrifugalni mikrofluidni uređaji su trenutno jedno od najboljih rješenja za POCT26,27.Njegov pogonski mehanizam je povoljan u tome što se pogonska sila može kontrolisati podešavanjem brzine rotacije.Međutim, nedostatak je što je centrifugalna sila uvijek usmjerena prema vanjskoj ivici uređaja, što otežava implementaciju višestepenih reakcija potrebnih za složenije analize.Iako su dodatne pokretačke sile (npr. kapilare 28, 29 i mnoge druge 30, 31, 32, 33, 34, 35) uz centrifugalnu silu uvedene za multifunkcionalno doziranje, još uvijek može doći do nepredviđenog prijenosa tekućine jer su te dodatne sile općenito naređenja. veličine niže od centrifugalne sile, što ih čini efikasnim samo u malim radnim opsezima ili nisu dostupni na zahtjev s oslobađanjem tekućine.Uključivanje pneumatskih manipulacija u centrifugalne mikrofluidike kao što su centrifugalne kinetičke metode 36, 37, 38, termopneumatske metode 39 i aktivne pneumatske metode 40 pokazalo se kao atraktivna alternativa.Uz kontrafugodinamički pristup, dodatna šupljina i spojni mikrokanali su integrirani u uređaj za vanjsko i unutarnje djelovanje, iako njegova efikasnost pumpanja (u rasponu od 75% do 90%) u velikoj mjeri ovisi o broju ciklusa pumpanja i viskoznosti tečnosti.U termopneumatskoj metodi, membrana od lateksa i komora za prijenos tekućine su posebno dizajnirani da zatvore ili ponovno otvore ulaz kada se zarobljeni volumen zraka zagrije ili ohladi.Međutim, podešavanje grijanja/hlađenja dovodi do problema sa sporim odgovorom i ograničava njegovu upotrebu u termosenzitivnim testovima (npr. amplifikacija lančane reakcije polimerazom (PCR).Uz aktivni pneumatski pristup, otpuštanje na zahtjev i kretanje prema unutra postižu se istovremenom primjenom pozitivnog tlaka i precizno usklađenim brzinama rotacije od strane motora velike brzine.Postoje i drugi uspješni pristupi koji koriste samo pneumatske aktuatore (pozitivni tlak 41, 42 ili negativni tlak 43) i dizajne normalno zatvorenih ventila.Sukcesivnom primjenom pritiska u pneumatskoj komori, tečnost se pumpa naprijed peristaltički, a normalno zatvoreni ventil sprječava povratni tok tekućine zbog peristaltike, čime se ostvaruju složene operacije tekućine.Međutim, trenutno postoji samo ograničen broj mikrofluidnih tehnologija koje mogu obavljati složene tečne operacije u jednom POCT uređaju, uključujući multifunkcionalno doziranje, otpuštanje na zahtjev, pouzdane performanse, dugotrajno skladištenje, rukovanje tekućinama visokog viskoziteta, i isplativa proizvodnja.Sve u isto vreme.Nedostatak funkcionalne operacije u više koraka također može biti jedan od razloga zašto je samo nekoliko komercijalnih POCT proizvoda kao što su Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat i Rhonda do danas uspješno predstavljeno na otvorenom tržištu.
U ovom radu predlažemo pneumatski mikrofluidni aktuator zasnovan na tehnologiji zelenog prstena mikro prekidača (FAST).FAST kombinuje sva potrebna svojstva u isto vrijeme za širok raspon reagensa od mikrolitara do mililitara.FAST se sastoji od elastičnih membrana, poluga i blokova.Bez primjene zračnog pritiska, membrane, poluge i blokovi mogu se čvrsto zatvoriti, a tekućina u njoj može se čuvati dugo vremena.Kada se primeni odgovarajući pritisak i podesi na dužinu poluge, dijafragma se širi i gura polugu u otvoreni položaj, omogućavajući fluidu da prođe.Ovo omogućava multifunkcionalno doziranje tekućina na kaskadni, simultani, sekvencijalni ili selektivni način.
Razvili smo PCR sistem koji koristi FAST za generiranje rezultata odgovora u uzorku za otkrivanje virusa influence A i B (IAV i IBV).Postigli smo donju granicu detekcije (LOD) od 102 kopije/mL, naš multipleks test je pokazao specifičnost za IAV i IBV i omogućio patotipizaciju virusa gripa.Rezultati kliničkog ispitivanja uzorka nazalnog brisa od 18 pacijenata i 18 zdravih osoba pokazuju dobru podudarnost u intenzitetu fluorescencije sa standardnim RT-PCR (Pearsonovi koeficijenti > 0,9).Rezultati kliničkog ispitivanja uzorka nazalnog brisa od 18 pacijenata i 18 zdravih osoba pokazuju dobru podudarnost u intenzitetu fluorescencije sa standardnim RT-PCR (Pearsonovi koeficijenti > 0,9).Rezultati kliničkog ispitivanja uz korištenje obraza mazke iz nosa kod 18 pacijenata i 18 zdravih osoba koje pokazuju dobru intezivnost fluorescencije standardnog OT-PCR (koeficijent Pirsona > 0,9).Rezultati kliničkih ispitivanja sa uzorkom nazalnog brisa od 18 pacijenata i 18 zdravih osoba pokazuju dobro slaganje između intenziteta fluorescencije standardnog RT-PCR (Pearsonovi koeficijenti > 0,9).0,9）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Rezultati kliničkog testiranja sa upotrebom nazalnih mazkova kod 18 pacijenata i 18 zdravih osoba pokazali su dobru usklađenost između intenzivnosti fluorescencije i standardnog OT-PCR (koeficijent Pirsona > 0,9).Rezultati kliničkih ispitivanja nazalnih briseva od 18 pacijenata i 18 zdravih osoba pokazali su dobru saglasnost između intenziteta fluorescencije i standardne RT-PCR (Pearsonov koeficijent > 0,9).Procijenjeni trošak materijala FAST-POCT uređaja je približno 1 USD (dodatna tabela 1) i može se dodatno smanjiti korištenjem metoda proizvodnje velikih razmjera (npr. brizganje).U stvari, POCT uređaji zasnovani na FAST-u imaju sve potrebne karakteristike koje je propisala SZO i kompatibilni su sa novim metodama biohemijskog testiranja kao što su termalni ciklus plazme44, imunoeseji bez amplifikacije45 i testovi funkcionalizacije nanotijela46 koji su okosnica POCT sistema.mogućnost.
Na sl.1a prikazuje strukturu FAST-POCT platforme, koja se sastoji od četiri tečne komore: komore za prethodno skladištenje, komore za mešanje, reakcione komore i komore za otpad.Ključ za kontrolu protoka fluida je FAST dizajn (koji se sastoji od elastičnih membrana, poluga i blokova) koji se nalazi u komori za prethodno skladištenje i komori za mešanje.Kao pneumatski aktivirana metoda, FAST dizajn pruža preciznu kontrolu protoka fluida, uključujući zatvoreno/otvoreno prebacivanje, raznovrsno doziranje, otpuštanje tečnosti na zahtjev, pouzdan rad (npr. neosjetljivost na vibracije okoline) i dugotrajno skladištenje.FAST-POCT platforma se sastoji od četiri sloja: pozadinskog sloja, sloja elastične folije, sloja plastične folije i pokrivnog sloja, kao što je prikazano u uvećanom prikazu na slici 1b (takođe je detaljno prikazano na dodatnim slikama S1 i S2 ).Svi kanali i komore za transport fluida (kao što su komore za prethodno skladištenje i reakcijske komore) ugrađene su u PLA (polimlečna kiselina) supstrate debljine od 0,2 mm (najtanji deo) do 5 mm.Elastični filmski materijal je PDMS debljine 300 µm koji se lako širi kada se primjenjuje pritisak zraka zbog svoje „tanke debljine“ i niskog modula elastičnosti (oko 2,25 MPa47).Sloj polietilenske folije izrađen je od polietilen tereftalata (PET) debljine 100 µm radi zaštite elastične folije od prekomjerne deformacije uslijed pritiska zraka.U skladu sa komorama, sloj supstrata ima poluge povezane sa pokrivnim slojem (napravljenim od PLA) šarkama za kontrolu protoka tečnosti.Elastična folija je zalijepljena na pozadinski sloj dvostranom ljepljivom trakom (ARseal 90880) i prekrivena plastičnom folijom.Tri sloja su montirana na podlogu korišćenjem T-klip dizajna u pokrivnom sloju.T-stega ima razmak između dvije noge.Kada je kopča umetnuta u žljeb, dvije noge su se lagano savijale, a zatim su se vratile u prvobitno stanje i čvrsto povezale poklopac i podlogu dok su prolazile kroz utor (dopunska slika S1).Četiri sloja se zatim spajaju pomoću konektora.
Šematski dijagram platforme koji ilustruje različite funkcionalne pregrade i karakteristike FAST-a.b Uvećani dijagram FAST-POCT platforme.c Fotografija platforme pored novčića od četvrtine američkog dolara.
Radni mehanizam FAST-POCT platforme prikazan je na slici 2. Ključne komponente su blokovi na osnovnom sloju i šarke na pokrivnom sloju, što rezultira interferentnim dizajnom kada se četiri sloja sklapaju pomoću T-oblika. .Kada se ne primjenjuje pritisak zraka (slika 2a), spoj sa smetnjom uzrokuje savijanje i deformaciju šarke, a sila zaptivanja se primjenjuje kroz polugu da pritisne elastični film na blok, a tekućina u šupljini zaptivke se definira kao zapečaćeno stanje.Treba napomenuti da je u ovom stanju poluga savijena prema van, kao što je prikazano na bočnoj strani na sl. 2a.Kada se dovede vazduh (Sl. 2b), elastična membrana se širi prema van prema poklopcu i gura polugu prema gore, otvarajući tako razmak između poluge i bloka da tečnost teče u sledeću komoru, koja se definiše kao otvoreno stanje. .Nakon otpuštanja pritiska zraka, poluga se može vratiti u prvobitni položaj i ostati zategnuta zbog elastičnosti šarke.Video snimci kretanja poluge prikazani su u dodatnom filmu S1.
A. Šematski dijagram i fotografije kada su zatvorene.U nedostatku pritiska, poluga pritiska membranu na blok i tečnost se zatvara.b U dobrom stanju.Kada se primeni pritisak, membrana se širi i gura polugu prema gore, tako da se kanal otvara i tečnost može da teče.c Odredite karakterističnu veličinu kritičnog pritiska.Karakteristične dimenzije uključuju dužinu poluge (L), razmak između klizača i šarke (l) i debljinu izbočine poluge (t).Fs je sila zbijanja u tački gasa B. q je ravnomjerno raspoređeno opterećenje poluge.Tx* predstavlja obrtni moment koji razvija zglobna poluga.Kritični pritisak je pritisak potreban za podizanje poluge i pokretanje tečnosti.d Teorijski i eksperimentalni rezultati odnosa između kritičnog pritiska i veličine elementa.Izvedeno je n = 6 nezavisnih eksperimenata i podaci su prikazani kao ± standardna devijacija.Sirovi podaci su predstavljeni kao datoteke sirovih podataka.
Razvijen je analitički model zasnovan na teoriji greda za analizu zavisnosti kritičnog pritiska Pc pri kojem se otvara jaz o geometrijskim parametrima (na primer, L je dužina poluge, l je rastojanje između bloka i šarka, S je poluga. Površina kontakta sa tečnošću t je debljina izbočine poluge, kao što je prikazano na slici 2c).Kao što je detaljno opisano u Dodatnim napomenama i Dodatnoj slici S3, jaz se otvara kada \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), gdje je Fs obrtni moment \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) da eliminiše sile povezane sa smetnjama i izazove savijanje šarke.Eksperimentalni odgovor i analitički model pokazuju dobro slaganje (slika 2d), pokazujući da kritični pritisak Pc raste sa povećanjem t/l i smanjenjem L, što se lako može objasniti klasičnim modelom grede, tj. moment raste sa t/lift .Dakle, naša teorijska analiza jasno pokazuje da se kritični pritisak može efikasno kontrolisati podešavanjem dužine poluge L i odnosa t/l, što predstavlja važnu osnovu za dizajn FAST-POCT platforme.
FAST-POCT platforma pruža multifunkcionalno doziranje (prikazano na slici 3a sa umetkom i eksperimentom), što je najvažnija karakteristika uspješnog POCT-a, gdje tekućine mogu teći u bilo kojem smjeru i bilo kojim redoslijedom (kaskadno, istovremeno, sekvencijalno) ili selektivno višekanalno dispensing .– funkcija doziranja.Na sl.3a(i) prikazuje kaskadni način doziranja u kojem su dvije ili više komora kaskadno raspoređene pomoću blokova za odvajanje različitih reaktanata i poluge za kontrolu otvorenog i zatvorenog stanja.Kada se primeni pritisak, tečnost teče iz gornje u donju komoru kaskadno.Treba napomenuti da se kaskadne komore mogu puniti vlažnim hemikalijama ili suhim hemikalijama kao što su liofilizirani prahovi.U eksperimentu na slici 3a(i), crveno mastilo iz gornje komore teče zajedno sa plavim prahom boje (bakar sulfat) u drugu komoru i postaje tamnoplavo kada dođe do donje komore.Takođe pokazuje kontrolni pritisak za fluid koji se pumpa.Slično, kada je jedna poluga spojena na dvije komore, ona postaje režim istovremenog ubrizgavanja, kao što je prikazano na sl.3a(ii), u kojoj se tečnost može ravnomerno rasporediti u dve ili više komora kada se primeni pritisak.Pošto kritični pritisak zavisi od dužine poluge, dužina poluge se može podesiti da bi se postigao sekvencijalni obrazac ubrizgavanja kao što je prikazano na sl.3a(iii).Duga poluga (sa kritičnim pritiskom Pc_long) spojena je na komoru B, a kratka poluga (sa kritičnim pritiskom Pc_short > Pc_long) je spojena na komoru A. Kako je pritisak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) primijenjen, samo je tekućina u crvenoj boji može teći u komoru B i kada je pritisak povećan na P2 (> Pc_short), plava tekućina može teći u komoru A. Ovaj uzastopni način ubrizgavanja primjenjuje se na različite tekućine koje se prenose u svoje povezane komore u nizu, što je ključno za uspješan POCT uređaj.Duga poluga (sa kritičnim pritiskom Pc_long) spojena je na komoru B, a kratka poluga (sa kritičnim pritiskom Pc_short > Pc_long) je spojena na komoru A. Kako je pritisak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) primijenjen, samo je tekućina u crvenoj boji može teći u komoru B i kada je pritisak povećan na P2 (> Pc_short), plava tekućina može teći u komoru A. Ovaj uzastopni način ubrizgavanja primjenjuje se na različite tekućine koje se prenose u svoje povezane komore u nizu, što je ključno za uspješan POCT uređaj.Dlinnyj ryčag (s kritičnim pritiskom Pc_long) je spojen sa kamerom B, a kratak ryčag (sa kritičkim pritiskom Pc_short > Pc_long) je spojen sa kamerom A. Priloženi davleni P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) samo židkost, odabrana crvena može teč u kameru B, i kada je pritisak bio povećan do P2 (> Pc_short), manja tečnost može da teče u kameru A. Ovaj režim uzastopnog pritiska primenjuje se na različite žičare, uzastopno se menja u odgovarajućoj kameri, što ima rešenje za rešavanje vrednosti za uspešan POCT.Duga poluga (sa kritičnim pritiskom Pc_long) spojena je na komoru B, a kratka poluga (sa kritičnim pritiskom Pc_short > Pc_long) je spojena na komoru A. Kada se primjenjuje pritisak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), samo je tekućina označena u crveno može teći u komoru B, a kada je pritisak povećan na P2 (> Pc_short), plava tekućina može teći u komoru A. Ovaj režim sekvencijalnog ubrizgavanja primjenjuje se na različite fluide koji se uzastopno prenose u odgovarajuće komore, što je kritično za uspješan POCT.uređaj. Dlinnyj ryčag (kritički pritisak Pc_long) povezan je sa kamerom B, a kratak ričag (kritički pritisak Pc_short > Pc_long) je povezan sa kamerom A.Duga ruka (kritični pritisak Pc_long) povezana je sa komorom B, a kratka ruka (kritični pritisak Pc_short > Pc_long) povezana je sa komorom A.Priloženo davljenje P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) u kameri B može djelovati samo crvena židkost, a povećanje davljenja do P2 (> Pc_short) u kameru A može djelovati sinja židkost.Kada se primeni pritisak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), samo crvena tečnost može da uđe u komoru B, a kada se pritisak poveća na P2 (> Pc_short), plava tečnost može ući u komoru A. Ovaj režim sekvencijalnog ubrizgavanja je pogodan za sekvencijalni prenos razne tečnosti u odgovarajuće komore, što je ključno za uspešan rad POCT uređaja.Slika 3a(iv) prikazuje način selektivnog ubrizgavanja, gdje je glavna komora imala kratku (sa kritičnim pritiskom Pc_short) i dugu polugu (sa kritičnim pritiskom Pc_long < Pc_short) koje su dodatno povezane sa komorom A i komorom B, respektivno. u drugi vazdušni kanal povezan sa komorom B. Da bi se tečnost prvo prebacila u komoru A, na uređaj su istovremeno primenjeni pritisak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i P2 (P2 > P1) sa P1 + P2 > Pc_short.Slika 3a(iv) prikazuje način selektivnog ubrizgavanja, gdje je glavna komora imala kratku (sa kritičnim pritiskom Pc_short) i dugu polugu (sa kritičnim pritiskom Pc_long < Pc_short) koje su dodatno povezane sa komorom A i komorom B, respektivno. u drugi vazdušni kanal povezan sa komorom B. Da bi se tečnost prvo prebacila u komoru A, na uređaj su istovremeno primenjeni pritisak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i P2 (P2 > P1) sa P1 + P2 > Pc_short.Na sl.3a(iv) pokazuje režim selektivnog pritiska, pri čemu osnovna kamera ima kratak (kritički pritisak Pc_short) i dugi ričag (sa kritičnim pritiskom Pc_long < Pc_short), koji se dodatno spajaju sa kamerom A i kamerom B.3a(iv) prikazan je način selektivnog ubrizgavanja, u kojem je glavna komora imala kratku (sa kritičnim pritiskom Pc_short) i dugu polugu (sa kritičnim pritiskom Pc_long < Pc_short), koje su dodatno povezane sa komorom A i komorom B, respektivno.na drugom vazdušnom kanalu, spojenom sa kamerom B. Da biste prvo prebacili tečnost u kameru A, u ustrojstvu su istovremeno primenili pritisak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i P2 (P2 > P1), gde je P1 + P2 > Pc_short.u drugi vazdušni kanal spojen na komoru B. Za prvo prenošenje fluida u komoru A, pritisci P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i P2 (P2 > P1) su istovremeno primijenjeni na uređaj, gdje je P1 + P2 > Pc_short. 3a(iv) pokazuje režim selektivnog pritiska, kada osnovna kamera ima kratak steržen (sa kritičnim pritiskom Pc_short) i dugi steržen (sa kritičkim pritiskom Pc_long < Pc_short), spojen sa kamerom A i kamerom B, prema tome, i u dopuni drugom vazdušnom kanalu, podklûčennomu k komnata B.3a(iv) prikazuje način selektivnog ubrizgavanja kada glavna komora ima kratku cev (kritični pritisak Pc_short) i dugačku stabljiku (kritični pritisak Pc_long < Pc_short) povezane sa komorom A i komorom B, i pored drugog prolaza za vazduh, povezan sa prostorijom B.Dakle, P2 sprečava tečnost da uđe u komoru B;u međuvremenu, ukupni pritisak P1 + P2 premašio je kritični pritisak da bi se aktivirala kraća poluga spojena na komoru A kako bi se omogućio protok tečnosti u komoru A. Zatim, kada je komora B trebalo da se napuni, samo treba da primenimo P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) u glavnoj komori da bi se aktivirala duga poluga i omogućila tečnost da teče u komoru B. Može se jasno primetiti od vremena t = 3 s do 9 s da je tečnost u komori A ostala konstantna dok se povećavala u komori B kada je primijenjen pritisak P1.u međuvremenu, ukupni pritisak P1 + P2 premašio je kritični pritisak da bi se aktivirala kraća poluga spojena na komoru A kako bi se omogućio protok tečnosti u komoru A. Zatim, kada je komora B trebalo da se napuni, samo treba da primenimo P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) u glavnoj komori da bi se aktivirala duga poluga i omogućila tečnost da teče u komoru B. Može se jasno primetiti od vremena t = 3 s do 9 s da je tečnost u komori A ostala konstantna dok se povećavala u komori B kada je primijenjen pritisak P1.Među temom, opće pritiska P1 + P2 prevladava kritični pritisak, da bi se aktivirao kratak ritam, spojen sa kamerom A, da bi omogućio tečnost u kameri A. Zatim, kada treba popuniti kameru B, potrebno nam je samo uključiti P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) u osnovnoj kameri, da biste aktivirali dugi ričag i dali tečnost u kameru B. Moguće je jasno posmatrati da je u periodu od t = 3 do 9 tečnost u kameri ostala konstantna, dok se u kameri povećava.U međuvremenu, ukupni pritisak P1 + P2 je premašio kritični pritisak da bi se aktivirala kraća poluga spojena na komoru A kako bi se omogućilo da tečnost teče u komoru A. Zatim kada treba da se napuni komora B, treba da primenimo samo P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) u glavnoj komori za aktiviranje duge poluge i puštanje tečnosti u komoru B. Jasno se može uočiti da je između t = 3 s i 9 s tečnost u komori A ostala konstantna, dok se u komori povećala.B kada se primjenjuje pritisak P1.Istovremeno, ukupni pritisak P1 + P2 premašuje kritični pritisak, aktivirajući kraću polugu koja povezuje komoru A, omogućavajući fluidu da teče u komoru A.Kada dođe vrijeme za punjenje komore A, jednostavno nanosimo P1 u glavnu komoru i P2 u sekundarnu komoru.Na ovaj način, ponašanje protoka može se selektivno prebacivati između kamera A i B. Ponašanje protoka četiri multifunkcionalna distribucijska načina može se naći u dodatnom filmu S2.
a Ilustracija multifunkcionalnog dodjeljivanja, tj. (i) kaskadno, (ii) simultano, (iii) sekvencijalno i (iv) selektivno dodjeljivanje.Krive predstavljaju tok posla i parametre ova četiri načina distribucije.b Rezultati testova dugotrajnog skladištenja u dejonizovanoj vodi i etanolu.Izvedeno je n = 5 nezavisnih eksperimenata i podaci su prikazani kao ± sd c.Demonstracije testa stabilnosti kada su uređaj FAST i uređaj kapilarnog ventila (CV) bili u (i) statičnom i (ii) vibrirajućem stanju.(iii) Volumen u odnosu na vrijeme za FAST i CV uređaje na različitim ugaonim frekvencijama.d Objavljivanje rezultata ispitivanja na zahtjev za (i) FAST uređaj i (ii) CV uređaj.(iii) Odnos između zapremine i vremena za FAST i CV uređaje koji koriste režim povremenog pritiska.Sve skale, 1 cm.Sirovi podaci se daju kao datoteke sirovih podataka.
Dugotrajno skladištenje reagensa je još jedna važna karakteristika uspješnog POCT uređaja koji će omogućiti neobučenom osoblju da rukuje više reagenasa.Dok su mnoge tehnologije pokazale svoj potencijal za dugotrajno skladištenje (npr. 35 mikrodozatora, 48 blister pakovanja i 49 štapića), potreban je namjenski pretinac za prijem paketa, što povećava troškove i složenost;osim toga, ovi mehanizmi skladištenja ne dozvoljavaju doziranje na zahtjev i rezultiraju rasipanjem reagensa zbog ostataka u pakovanju.Mogućnost dugotrajnog skladištenja potvrđena je provođenjem ubrzanog testa vijeka trajanja pomoću CNC obrađenog PMMA materijala zbog njegove male hrapavosti i otpornosti na prodiranje plina (dodatna slika S5).Test aparat je napunjen dejonizovanom vodom (dejonizovanom vodom) i 70% etanolom (simulacija isparljivih reagensa) na 65°C tokom 9 dana.I deionizirana voda i etanol pohranjeni su pomoću aluminijske folije kako bi se blokirao pristup odozgo.Arrheniusova jednadžba i energija aktivacije penetracije navedene u literaturi50,51 korištene su za izračunavanje ekvivalenta u realnom vremenu.Na sl.3b prikazuje prosječne rezultate gubitka težine za 5 uzoraka čuvanih na 65°C tokom 9 dana, što je ekvivalentno 0,30% za dejonizovanu vodu i 0,72% za 70% etanol tokom 2 godine na 23°C.
Na sl.3c prikazuje test vibracija.Budući da je kapilarni ventil (CV) najpopularnija metoda rukovanja tekućinom među postojećim POCT28,29 uređajima, za poređenje je korišten CV uređaj širine 300 µm i dubine 200 µm.Može se vidjeti da kada oba uređaja miruju, tekućina u FAST-POCT platformi zaptiva i tekućina u CV uređaju se blokira zbog naglog širenja kanala, što smanjuje kapilarne sile.Međutim, kako se kutna frekvencija orbitalnog vibratora povećava, tekućina u FAST-POCT platformi ostaje zatvorena, ali tekućina u CV uređaju teče u donju komoru (vidi i Dodatni film S3).Ovo sugerira da deformabilne šarke FAST-POCT platforme mogu primijeniti jaku mehaničku silu na modul kako bi se tečnost u komori čvrsto zatvorila.Međutim, u CV uređajima tečnost se zadržava zbog ravnoteže između čvrste, vazdušne i tečne faze, stvarajući nestabilnost, a vibracije mogu poremetiti ravnotežu i uzrokovati neočekivano ponašanje protoka.Prednost FAST-POCT platforme je što pruža pouzdanu funkcionalnost i izbjegava kvarove u prisustvu vibracija koje se obično javljaju tokom isporuke i rada.
Još jedna važna karakteristika FAST-POCT platforme je njeno izdavanje na zahtjev, što je ključni zahtjev za kvantitativnu analizu.Na sl.3d upoređuje izdanje na zahtjev FAST-POCT platforme i CV uređaja.Od sl.3d(iii) vidimo da FAST uređaj brzo reaguje na signal pritiska.Kada je pritisak primijenjen na FAST-POCT platformu, tekućina je tekla, kada je pritisak otpušten, protok je odmah prestao (slika 3d(i)).Ova akcija se može objasniti brzim elastičnim vraćanjem šarke, koja pritišće polugu natrag na blok, zatvarajući komoru.Međutim, tekućina je nastavila teći u CV uređaju, što je na kraju rezultiralo neočekivanom zapreminom tekućine od približno 100 µl nakon što je pritisak otpušten (Slika 3d(ii) i Dodatni film S4).Ovo se može objasniti nestankom efekta kapilarnog pričvršćivanja nakon potpunog vlaženja CV-a nakon prve injekcije.
Sposobnost rukovanja tekućinama različite vlažnosti i viskoziteta u istom uređaju ostaje izazov za POCT aplikacije.Slabo vlaženje može dovesti do curenja ili drugog neočekivanog ponašanja protoka u kanalima, a pomoćna oprema kao što su vrtložne miješalice, centrifuge i filteri često je potrebna za pripremu visoko viskoznih tekućina 52 .Testirali smo odnos između kritičnog pritiska i svojstava fluida (sa širokim rasponom kvašenja i viskoziteta).Rezultati su prikazani u Tabeli 1 i Video S5.Vidi se da se u komoru mogu zatvoriti tečnosti različite kvašljivosti i viskoziteta, a kada se primeni pritisak, čak i tečnosti viskoziteta do 5500 cP mogu se preneti u susednu komoru, što omogućava detekciju uzoraka sa visokim viskozitet (tj. sputum, vrlo viskozan uzorak koji se koristi za dijagnozu respiratornih bolesti).
Kombinacijom gore navedenih multifunkcionalnih uređaja za doziranje može se razviti širok raspon POCT uređaja zasnovanih na FAST-u.Primjer je prikazan na slici 1. Postrojenje sadrži komoru za pretskladištenje, komoru za miješanje, reakcionu komoru i komoru za otpad.Reagensi se mogu čuvati u komori za prethodno skladištenje tokom dužeg vremenskog perioda, a zatim ispuštati u komoru za mešanje.Uz pravi pritisak, miješani reaktanti se mogu selektivno prenijeti u komoru za otpad ili reakcijsku komoru.
Budući da je PCR detekcija zlatni standard za otkrivanje patogena kao što su H1N1 i COVID-19 i uključuje više koraka reakcije, koristili smo FAST-POCT platformu za PCR detekciju kao aplikaciju.Na sl.4 prikazuje proces PCR testiranja koristeći FAST-POCT platformu.Prvo, reagens za eluiranje, reagens magnetnih mikrozrnaca, rastvor za ispiranje A i rastvor za ispiranje W su pipetirani u komore za prethodno skladištenje E, M, W1 i W2, respektivno.Faze adsorpcije RNK prikazane su na sl.4a i su kako slijedi: (1) kada se primijeni pritisak P1 (=0,26 bara), uzorak se kreće u komoru M i ispušta se u komoru za miješanje.(2) Vazdušni pritisak P2 (= 0,12 bar) se dovodi preko priključka A spojenog na dno komore za mešanje.Iako su brojne metode miješanja pokazale svoj potencijal u miješanju tekućina na POCT platformama (npr. serpentinsko miješanje 53, nasumično miješanje 54 i šaržno miješanje 55), njihova efikasnost i djelotvornost miješanja još uvijek nisu zadovoljavajuće.Usvaja metodu miješanja mjehurića, u kojoj se zrak uvodi na dno komore za miješanje kako bi se stvorili mjehurići u tekućini, nakon čega moćni vrtlog može postići potpuno miješanje u roku od nekoliko sekundi.Provedeni su eksperimenti miješanja mjehurića, a rezultati su prikazani na dodatnoj slici S6.Može se videti da kada se primeni pritisak od 0,10 bara, potpuno mešanje traje oko 8 sekundi.Povećanjem pritiska na 0,20 bara, potpuno mešanje se postiže za oko 2 sekunde.Metode za izračunavanje efikasnosti mešanja predstavljene su u odeljku Metode.(3) Koristite rubidijumski magnet da izvučete kuglice, a zatim postavite P3 (= 0,17 bara) pod pritiskom kroz priključak P da biste reagense pomerili u komoru za otpad.Na sl.4b,c prikazuje korake ispiranja za uklanjanje nečistoća iz uzorka kako slijedi: (1) Rastvor za pranje A iz komore W1 se ispušta u komoru za miješanje pod pritiskom P1.(2) Zatim izvršite proces miješanja mjehurića.(3) Rastvor za pranje A prenosi se u komoru za otpadnu tečnost, a mikrozrnca u komori za mešanje se izvlače pomoću magneta.Pranje W (slika 4c) bilo je slično pranju A (slika 4b).Treba napomenuti da je svaki korak pranja A i W izveden dva puta.Slika 4d pokazuje korake eluiranja za eluiranje RNK iz kuglica;koraci uvođenja elucije i miješanja su isti kao i koraci adsorpcije RNK i ispiranja opisani gore.Kako se reagensi za eluiranje prenose u PCR reakcionu komoru pod pritiscima P3 i P4 (=0,23 bara), dostiže se kritični pritisak da bi se zatvorio krak PCR reakcione komore.Slično, pritisak P4 takođe pomaže da se zatvori prolaz u komoru za otpad.Stoga su svi reagensi za eluiranje ravnomjerno raspoređeni između četiri PCR reakcijske komore kako bi se pokrenule multipleks PCR reakcije.Gornji postupak je predstavljen u Dodatnom filmu S6.
U koraku adsorpcije RNK, uzorak se uvodi u ulaz M i ubrizgava u komoru za miješanje zajedno sa prethodno uskladištenim rastvorom kuglica.Nakon miješanja i uklanjanja granula, reagensi se distribuiraju u komoru za otpad.b i c koraka ispiranja, uvesti različite prethodno uskladištene reagense za pranje u komoru za miješanje i nakon miješanja i uklanjanja kuglica, prebaciti reagense u komoru za otpadnu tekućinu.d Korak eluiranja: Nakon uvođenja reagenasa za eluiranje, miješanja i ekstrakcije zrna, reagensi se prenose u PCR reakcijsku komoru.Krive pokazuju tok posla i povezane parametre različitih faza.Pritisak je pritisak koji se vrši kroz pojedinačne komore.Volumen je zapremina tečnosti u komori za mešanje.Sve skale su 1 cm.Sirovi podaci se daju kao datoteke sirovih podataka.
Provedena je procedura PCR testiranja i Dodatna slika S7 predstavlja termalne profile uključujući 20 minuta vremena reverzne transkripcije i 60 minuta termalnog vremena ciklusa (95 i 60 °C), pri čemu je jedan termalni ciklus 90 s (Dopunski film S7)..FAST-POCT zahtijeva manje vremena za završetak jednog termičkog ciklusa (90 sekundi) nego konvencionalni RT-PCR (180 sekundi za jedan termički ciklus).Ovo se može objasniti visokim odnosom površine prema zapremini i niskom toplotnom inercijom mikro-PCR reakcione komore.Površina komore je 96,6 mm2, a zapremina komore je 25 mm3, što čini odnos površine i zapremine približno 3,86.Kao što se vidi na dodatnoj slici S10, područje za testiranje PCR naše platforme ima žljeb na stražnjoj ploči, što čini dno PCR komore debljine 200 µm.Toplotno provodljiva elastična podloga pričvršćena je na grijaću površinu regulatora temperature, osiguravajući čvrst kontakt sa stražnjom stranom kutije za testiranje.Ovo smanjuje termičku inerciju platforme i poboljšava efikasnost grijanja/hlađenja.Tokom termičkog ciklusa, parafin ugrađen u platformu se topi i teče u PCR reakcijsku komoru, djelujući kao zaptivač kako bi se spriječilo isparavanje reagensa i kontaminacija okoline (pogledajte Dodatni film S8).
Svi gore opisani procesi PCR detekcije su potpuno automatizirani korištenjem FAST-POCT instrumenta napravljenog po narudžbi, koji se sastoji od programirane jedinice za kontrolu pritiska, jedinice za magnetnu ekstrakciju, jedinice za kontrolu temperature i jedinice za hvatanje i obradu fluorescentnog signala.Treba napomenuti da smo koristili FAST-POCT platformu za izolaciju RNK, a zatim smo koristili ekstrahovane uzorke RNK za PCR reakcije koristeći FAST-POCT sistem i desktop PCR sistem za poređenje.Rezultati su bili gotovo isti kao što je prikazano na dodatnoj slici S8.Operater obavlja jednostavan zadatak: uvodi uzorak u M-komoru i ubacuje platformu u instrument.Rezultati kvantitativnih testova dostupni su za oko 82 minuta.Detaljne informacije o FAST-POCT alatima možete pronaći na dodatnoj slici.C9, C10 i C11.
Gripa uzrokovana virusima gripe A (IAV), B (IBV), C (ICV) i D (IDV) je uobičajena globalna pojava.Od toga, IAV i IBV su odgovorni za najteže slučajeve i sezonske epidemije, zaraze 5-15% svjetske populacije, uzrokujući 3-5 miliona teških slučajeva i uzrokujući 290.000-650.000 smrtnih slučajeva godišnje.Respiratorne bolesti56,57.Rana dijagnoza IAV i IB je ključna za smanjenje morbiditeta i povezanog ekonomskog opterećenja.Među dostupnim dijagnostičkim tehnikama, lančana reakcija polimeraze reverzne transkriptaze (RT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i najpreciznijom (>99%)58,59.Među dostupnim dijagnostičkim tehnikama, lančana reakcija polimeraze reverzne transkriptaze (RT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i najpreciznijom (>99%)58,59.Sredi dostupnih dijagnostičkih metoda polimerazna cepna reakcija s povratnom transkriptazom (OT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i točnom (> 99%)58,59.Među dostupnim dijagnostičkim metodama, lančana reakcija polimeraze reverzne transkriptaze (RT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i najpreciznijom (> 99%)58,59. Od dostupnih dijagnostičkih metoda polimerazna cepna reakcija s povratnom transkriptazoom (OT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i točnom (>99%)58,59.Od dostupnih dijagnostičkih metoda, lančana reakcija polimeraze reverzne transkriptaze (RT-PCR) smatra se najosjetljivijom, specifičnom i najpreciznijom (>99%)58,59.Međutim, tradicionalne RT-PCR metode zahtijevaju ponovljeno pipetiranje, miješanje, doziranje i prijenos tekućine, ograničavajući njihovu upotrebu od strane profesionalaca u okruženjima s ograničenim resursima.Ovde je FAST-POCT platforma korišćena za PCR detekciju IAV i IBV, respektivno, da bi se dobila njihova donja granica detekcije (LOD).Osim toga, IAV i IBV su multipleksirani kako bi se razlikovali između različitih patotipova među vrstama, pružajući obećavajuću platformu za genetsku analizu i sposobnost preciznog liječenja bolesti.
Na sl.5a prikazuje rezultate HAV PCR testiranja koristeći 150 µl pročišćene virusne RNK kao uzorak.Na sl.5a(i) pokazuje da pri koncentraciji HAV od 106 kopija/ml, intenzitet fluorescencije (ΔRn) može doseći 0,830, a kada se koncentracija smanji na 102 kopije/ml, ΔRn i dalje može dostići 0,365, što odgovara većem prazne negativne kontrolne grupe (0,002), oko 100 puta više.Za kvantifikaciju zasnovanu na šest nezavisnih eksperimenata, generisana je linearna kalibraciona kriva između log koncentracije i praga ciklusa (Ct) IAV (slika 5a(ii)), R2 = 0,993, u rasponu od 102-106 kopija/mL.rezultati se dobro slažu sa konvencionalnim RT-PCR metodama.Na sl.5a(iii) prikazuje fluorescentne slike rezultata testa nakon 40 ciklusa FAST-POCT platforme.Otkrili smo da FAST-POCT platforma može otkriti HAV do 102 kopije/mL.Međutim, tradicionalna metoda nema Ct vrijednost od 102 kopije/mL, što je čini LOD od oko 103 kopije/mL.Pretpostavili smo da bi to moglo biti zbog visoke efikasnosti miješanja mjehurića.PCR test eksperimenti su izvedeni na pročišćenoj IAV RNK kako bi se procijenile različite metode miješanja, uključujući miješanje (ista metoda miješanja kao u konvencionalnoj RT-PCR operaciji), miješanje u bočici (ova metoda, 3 s na 0,12 bara) i bez miješanja kao kontrolna grupa ..Rezultati se mogu naći na dodatnoj slici S12.Može se vidjeti da su pri višoj koncentraciji RNK (106 kopija/mL), vrijednosti Ct različitih metoda miješanja gotovo iste kao kod miješanja mjehurića.Kada je koncentracija RNK pala na 102 kopije/mL, miješana mješavina i kontrole nisu imale Ct vrijednosti, dok je metoda mjehurića i dalje davala Ct vrijednost od 36,9, što je bilo ispod Ct praga od 38. Rezultati pokazuju dominantnu karakteristiku miješanja vezikule, što je takođe demonstrirano u drugoj literaturi, što takođe može objasniti zašto je osetljivost FAST-POCT platforme nešto veća od konvencionalne RT-PCR.Na sl.5b prikazuje rezultate PCR analize pročišćenih uzoraka IBV RNK u rasponu od 101 do 106 kopija/ml.Rezultati su bili slični IAV testu, postižući R2 = 0,994 i LOD od 102 kopije/mL.
PCR analiza virusa influence A (IAV) sa koncentracijama IAV u rasponu od 106 do 101 kopija/mL koristeći TE pufer kao negativnu kontrolu (NC).(i) Kriva fluorescencije u realnom vremenu.(ii) Linearna kalibraciona kriva između logaritamske koncentracije IAV RNK i praga ciklusa (Ct) za FAST i konvencionalne metode testiranja.(iii) IAV FAST-POCT fluorescentna slika nakon 40 ciklusa.b, PCR detekcija virusa influence B (IBV) sa (i) fluorescentnim spektrom u realnom vremenu.(ii) Linearna kalibraciona kriva i (iii) FAST-POCT IBV fluorescentna slika nakon 40 ciklusa.Donja granica detekcije (LOD) za IAV i IBV koristeći FAST-POCT platformu bila je 102 kopije/mL, što je niže od konvencionalnih metoda (103 kopije/mL).c Rezultati multipleks testa za IAV i IBV.GAPDH je korišten kao pozitivna kontrola, a TE pufer je korišten kao negativna kontrola kako bi se spriječila moguća kontaminacija i pozadinsko pojačanje.Mogu se razlikovati četiri različita tipa uzoraka: (1) negativni uzorci samo za GAPDH (“IAV-/IBV-”);(2) IAV infekcija (“IAV+/IBV-”) sa IAV i GAPDH;(3) IBV infekcija (“IAV-/IBV+”) sa IBV i GAPDH;(4) Infekcija IAV/IBV (“IAV+/IBV+”) sa IAV, IBV i GAPDH.Isprekidana linija predstavlja liniju praga.n = 6 biološki nezavisnih eksperimenata, podaci su prikazani kao ± standardna devijacija.Sirovi podaci su predstavljeni kao datoteke sirovih podataka.
Na sl.5c prikazuje rezultate testa multipleksiranja za IAV/IBV.Ovdje je lizat virusa korišten kao otopina uzorka umjesto pročišćene RNK, a četiri prajmera za IAV, IBV, GAPDH (pozitivna kontrola) i TE pufer (negativna kontrola) dodana su u četiri različite reakcione komore FAST-POCT platforme.Ovdje se koriste pozitivne i negativne kontrole kako bi se spriječila moguća kontaminacija i pozadinsko poboljšanje.Testovi su podijeljeni u četiri grupe: (1) GAPDH-negativni uzorci (“IAV-/IBV-”);(2) Inficirani IAV (“IAV+/IBV-”) u odnosu na IAV i GAPDH;(3) IBV-.inficirani (“IAV-”) -/IBV+”) IBV i GAPDH;(4) IAV/IBV (“IAV+/IBV+”) infekcija sa IAV, IBV i GAPDH.Na sl.5c pokazuje da kada su primijenjeni negativni uzorci, intenzitet fluorescencije ΔRn komore pozitivne kontrole bio je 0,860, a ΔRn IAV i IBV je bio sličan negativnoj kontroli (0,002).Za grupe IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ i IAV+/IBV+, IAV/GAPDH, IBV/GAPDH i IAV/IBV/GAPDH kamere su pokazale značajan intenzitet fluorescencije, respektivno, dok su druge kamere čak pokazivale intenzitet fluorescencije u pozadini nivo od 40 nakon termičkog ciklusa.Prema gore navedenim testovima, FAST-POCT platforma je pokazala izuzetnu specifičnost i omogućila nam da istovremeno patotipiziramo različite viruse gripe.
Da bismo potvrdili kliničku primjenjivost FAST-POCT-a, testirali smo 36 kliničkih uzoraka (uzorci brisa nosa) od pacijenata sa IB (n=18) i ne-IB kontrola (n=18) (Slika 6a).Informacije o pacijentima su predstavljene u Dodatnoj tabeli 3. Status infekcije IB je nezavisno potvrđen, a protokol studije je odobrila prva pridružena bolnica Univerziteta Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang).Svaki uzorak pacijenata podijeljen je u dvije kategorije.Jedan je obrađen pomoću FAST-POCT, a drugi je obrađen pomoću desktop PCR sistema (SLAN-96P, Kina).Oba testa koriste iste komplete za pročišćavanje i detekciju.Na sl.6b prikazuje rezultate FAST-POCT i konvencionalne reverzne transkripcije PCR (RT-PCR).Uporedili smo intenzitet fluorescencije (FAST-POCT) sa -log2(Ct), gdje je Ct prag ciklusa za konvencionalni RT-PCR.Postojala je dobra saglasnost između ove dvije metode.FAST-POCT i RT-PCR pokazali su snažnu pozitivnu korelaciju sa vrijednošću Pearsonovog omjera (r) od 0,90 (Slika 6b).Zatim smo procijenili dijagnostičku tačnost FAST-POCT-a.Raspodjela intenziteta fluorescencije (FL) za pozitivne i negativne uzorke date su kao nezavisna analitička mjera (slika 6c).Vrijednosti FL su bile značajno veće kod pacijenata sa IB nego u kontrolne skupine (****P = 3,31 × 10-19; dvostrani t-test) (slika 6d).Zatim su ucrtane krive radnih karakteristika IBV prijemnika (ROC).Otkrili smo da je dijagnostička tačnost bila veoma dobra, sa površinom ispod krive 1 (slika 6e).Imajte na umu da zbog obaveznog naručivanja maski u Kini zbog COVID-19 od 2020. godine, nismo identificirali pacijente s IBD-om, tako da su svi pozitivni klinički uzorci (tj. uzorci nazalnih briseva) bili samo za IBV.
Dizajn kliničke studije.Ukupno 36 uzoraka, uključujući 18 uzoraka pacijenata i 18 kontrola bez gripe, analizirano je korištenjem FAST-POCT platforme i konvencionalne RT-PCR.b Procijenite analitičku konzistentnost između FAST-POCT PCR-a i konvencionalnog RT-PCR-a.Rezultati su bili u pozitivnoj korelaciji (Pearson r = 0,90).c Nivoi intenziteta fluorescencije kod 18 pacijenata sa IB i 18 kontrola.d Kod pacijenata sa IB (+), vrijednosti FL su bile značajno veće nego u kontrolnoj grupi (-) (****P = 3,31 × 10-19; dvostrani t-test; n = 36).Za svaki kvadratni grafikon, crni marker u centru predstavlja medijanu, a donja i gornja linija okvira predstavljaju 25. odnosno 75. percentile.Brkovi se protežu do minimalnih i maksimalnih tačaka podataka, koje se ne smatraju izvanrednim.e ROC kriva.Isprekidana linija d predstavlja graničnu vrijednost procijenjenu ROC analizom.AUC za IBV je 1. Neobrađeni podaci se daju kao datoteke neobrađenih podataka.
U ovom članku predstavljamo FAST, koji ima karakteristike potrebne za idealan POCT.Prednosti naše tehnologije uključuju: (1) Svestrano doziranje (kaskadno, simultano, sekvencijalno i selektivno), otpuštanje na zahtjev (brzo i proporcionalno oslobađanje primijenjenog pritiska) i pouzdan rad (vibracije na 150 stepeni) (2) dugotrajno skladištenje (2 godine ubrzanog testiranja, gubitak težine oko 0,3%);(3) sposobnost rada sa tečnostima sa širokim rasponom kvašenja i viskoziteta (viskozitet do 5500 cP);(4) Ekonomičan (Procijenjena cijena materijala za FAST-POCT PCR uređaj je približno 1 USD).Kombinacijom multifunkcionalnih dispenzera demonstrirana je i primijenjena integrirana FAST-POCT platforma za PCR detekciju virusa gripe A i B.FAST-POCT traje samo 82 minute.Klinički testovi sa 36 uzoraka nazalnih briseva pokazali su dobru podudarnost u intenzitetu fluorescencije sa standardnim RT-PCR (Pearsonovi koeficijenti > 0,9).Klinički testovi sa 36 uzoraka nazalnih briseva pokazali su dobru podudarnost u intenzitetu fluorescencije sa standardnim RT-PCR (Pearsonovi koeficijenti > 0,9).Klinički testovi sa 36 uzoraka mazkova iz nosa pokazali su dobru usklađenost intenzivnosti fluorescencije standardnog OT-PCR (koeficijent Pirsona > 0,9).Klinička ispitivanja sa 36 uzoraka nazalnih briseva pokazala su dobru saglasnost sa intenzitetom fluorescencije standardnog RT-PCR (Pearsonovi koeficijenti > 0,9).RT-PCR Kliničko ispitivanje 36 obrazova mazkova iz nosa pokazalo je dobru sovpadnost intenzivnosti fluorescencije sa standardnim OT-PCR (koeficijent Pirsona > 0,9).Kliničko ispitivanje 36 uzoraka nazalnih briseva pokazalo je dobro slaganje intenziteta fluorescencije sa standardnim RT-PCR (Pearsonov koeficijent > 0,9).Paralelno sa ovim radom, različite nove biohemijske metode (npr. termalni ciklus plazme, imunoeseji bez amplifikacije i testovi funkcionalizacije nanotijela) pokazali su svoj potencijal u POCT-u.Međutim, zbog nedostatka potpuno integrirane i robusne POCT platforme, ove metode neizbježno zahtijevaju odvojene postupke predobrade (npr. izolaciju RNK44, inkubaciju45 i ispiranje46), što dodatno nadopunjuje trenutni rad s ovim metodama za implementaciju naprednih POCT funkcija sa tražene parametre.performanse dohvaćanja u odgovoru-izlazu.U ovom radu, iako je vazdušna pumpa koja se koristi za aktiviranje FAST ventila dovoljno mala da se integriše u stoni instrument (sl. S9, S10), ona i dalje troši značajnu snagu i stvara buku.U principu, pneumatske pumpe manjeg oblika mogu se zamijeniti drugim sredstvima, kao što je korištenje elektromagnetne sile ili aktiviranje prstima.Dalja poboljšanja mogu uključivati, na primjer, prilagođavanje kompleta za različite i specifične biohemijske testove, koristeći nove metode detekcije koje ne zahtijevaju sisteme grijanja/hlađenja, čime se osigurava POCT platforma bez alata za PCR aplikacije.Vjerujemo da s obzirom na to da FAST platforma pruža način za manipulaciju tekućinama, vjerujemo da predložena tehnologija FAST predstavlja potencijal za stvaranje zajedničke platforme ne samo za biomedicinsko testiranje, već i za praćenje okoliša, testiranje kvalitete hrane, sintezu materijala i lijekova. ..
Prikupljanje i upotrebu uzoraka nazalnih briseva kod ljudi odobrio je Etički komitet prve pridružene bolnice Univerziteta Zhejiang (IIT20220330B).Prikupljeno je 36 uzoraka brisa nosa, uključujući 16 odraslih osoba < 30 godina, 7 odraslih > 40 godina i 19 muškaraca i 17 žena.Prikupljeno je 36 uzoraka brisa nosa, uključujući 16 odraslih osoba < 30 godina, 7 odraslih > 40 godina i 19 muškaraca i 17 žena.Bilo je sabrano 36 obrazova iz nosa, među kojima su učestvovali 16 odraslih < 30 godina, 7 odraslih starijih od 40 godina, 19 muškaraca i 17 žena.Uzeto je 36 briseva nosa od 16 odraslih osoba <30 godina, 7 odraslih osoba starijih od 40 godina, 19 muškaraca i 17 žena.Demografski podaci prikazani su u Dodatnoj tabeli 3. Informisani pristanak je dobijen od svih učesnika.Za sve učesnike se sumnjalo da imaju grip i dobrovoljno su testirani bez naknade.
FAST baza i poklopac su napravljeni od polimliječne kiseline (PLA) i štampani su na Ender 3 Pro 3D štampaču (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Dvostrana traka kupljena je od Adhesives Research, Inc. Model 90880. PET film debljine 100 µm kupljen je od McMaster-Carra.I ljepilo i PET folija su izrezani pomoću rezača Silhouette Cameo 2 iz Silhouette America, Inc. Elastični film je napravljen od PDMS materijala brizganjem.Prvo je PET okvir debljine 200 µm izrezan laserskim sistemom i zalijepljen na PMMA lim debljine 3 mm pomoću dvostrane ljepljive trake od 100 µm.Prekursor PDMS (Sylgard 184; Dio A: Dio B = 10:1, Dow Corning) je zatim izliven u kalup i staklena šipka je korištena za uklanjanje viška PDMS-a.Nakon stvrdnjavanja na 70°C tokom 3 sata, PDMS film debljine 300 μm mogao bi se oguliti sa kalupa.
Fotografije za raznovrsnu distribuciju, objavljivanje na zahtjev i pouzdane performanse snimljene su kamerom velike brzine (Sony AX700 1000 fps).Orbitalni šejker korišten u testu pouzdanosti kupljen je od SCILOGEX-a (SCI-O180).Pritisak vazduha stvara vazdušni kompresor, a nekoliko digitalnih preciznih regulatora pritiska se koristi za podešavanje vrednosti pritiska.Proces testiranja ponašanja protoka je sljedeći.Unaprijed određena količina tekućine je ubrizgana u uređaj za testiranje, a kamera velike brzine je korištena za snimanje ponašanja protoka.Fotografije su zatim uzete iz video zapisa ponašanja protoka u fiksnim vremenima, a preostala površina je izračunata pomoću softvera Image-Pro Plus, koji je zatim pomnožen sa dubinom kamere da bi se izračunala zapremina.Detalji o sistemu za testiranje ponašanja protoka mogu se naći na dodatnoj slici S4.
Ubrizgajte 50 µl mikrozrnaca i 100 µl dejonizirane vode u uređaj za miješanje u bočici.Fotografije mešovitih performansi snimljene su kamerom velike brzine svakih 0,1 sekundu pri pritiscima od 0,1 bara, 0,15 bara i 0,2 bara.Informacije o pikselima tokom procesa mešanja mogu se dobiti iz ovih slika pomoću softvera za obradu fotografija (Photoshop CS6).A efikasnost miješanja može se postići sa sljedećom jednačinom 53.
gdje je M efikasnost miješanja, N je ukupan broj uzoraka piksela, a ci i \(\bar{c}\) su normalizirane i očekivane normalizirane koncentracije.Efikasnost mešanja se kreće od 0 (0%, nepomešano) do 1 (100%, potpuno mešano).Rezultati su prikazani na dodatnoj slici S6.
RT-PCR komplet u realnom vremenu za IAV i IBV, uključujući IAV i IBV RNA uzorke (kat. br. RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Kina), Tris-EDTA pufer (TE pufer br. B541019 , Sangon Biotech, Kina), komplet za pročišćavanje RNK pozitivne kontrole (Br. dijela Z-ME-0010, Liferiver, Kina) i GAPDH rješenje (Br. dijela M591101, Sangon Biotech, Kina) su komercijalno dostupni.Komplet za pročišćavanje RNK uključuje pufer za vezivanje, ispiranje A, ispiranje W, eluens, magnetne mikrozrnce i akrilni nosač.IAV i IBV RT-PCR kompleti u realnom vremenu uključuju IFVA mješavinu za PCR detekciju nukleinske kiseline i RT-PCR enzim.Dodajte 6 µl AcrylCarrier-a i 20 µl magnetnih perli u 500 µl otopine pufera za vezivanje, dobro promućkajte i zatim pripremite otopinu zrna.Dodati 21 ml etanola u ispiranje A i W, dobro promućkati da dobijete rastvore za ispiranje A i W, respektivno.Zatim je 18 µl fluorescentne PCR mješavine sa IFVA nukleinskom kiselinom i 1 µl RT-PCR enzima dodato u 1 µl TE rastvora, promućkano i centrifugirano nekoliko sekundi, dobijajući 20 µl IAV i IBV prajmera.
Slijedite sljedeću proceduru prečišćavanja RNK: (1) RNK adsorpcija.Odpipetirajte 526 µl otopine peleta u epruvetu za centrifugiranje od 1,5 ml i dodajte 150 µl uzorka, a zatim ručno protresite epruvetu gore-dolje 10 puta.Prenesite 676 µl smjese u afinitetnu kolonu i centrifugirajte na 1,88 x 104 g 60 sekundi.Naknadni odvodi se zatim odbacuju.(2) Prva faza pranja.Dodajte 500 µl otopine za ispiranje A u afinitetnu kolonu, centrifugirajte na 1,88 x 104 g 40 s i bacite istrošeni rastvor.Ovaj proces pranja je ponovljen dva puta.(3) druga faza pranja.Dodati 500 µl otopine za ispiranje W u afinitetnu kolonu, centrifugirati na 1,88×104 g 15 s i baciti istrošenu otopinu.Ovaj proces pranja je ponovljen dva puta.(4) Elucija.Dodati 200 µl eluata u afinitetnu kolonu i centrifugirati na 1,88 x 104 g 2 min.(5) RT-PCR: eluat je ubrizgan u 20 μl rastvora prajmera u PCR epruveti, zatim je epruveta stavljena u aparat za PCR test u realnom vremenu (SLAN-96P) da bi se izvršio RT-PCR proces.Cijeli proces detekcije traje otprilike 140 minuta (20 minuta za RNA pročišćavanje i 120 minuta za PCR detekciju).
Preliminarno je dodato 526 µl otopine perli, 1000 µl otopine za ispiranje A, 1000 µl otopine za ispiranje W, 200 µl eluata i 20 µl otopine prajmera i pohranjeno u komore M, W1, W2, E i PCR detekcija.Montaža platforme.Zatim je 150 µl uzorka pipetirano u komoru M i FAST-POCT platforma je umetnuta u instrument za testiranje prikazan na dodatnoj slici S9.Nakon otprilike 82 minute, rezultati testa su bili dostupni.
Osim ako nije drugačije naznačeno, svi rezultati testa su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD nakon najmanje šest ponavljanja koristeći samo FAST-POCT platformu i biološki nezavisne uzorke.Nijedan podatak nije isključen iz analize.Eksperimenti nisu slučajni.Istraživači nisu bili slijepi za grupne zadatke tokom eksperimenta.
Za više informacija o dizajnu studije, pogledajte sažetak Izvještaja o istraživanju prirode povezan s ovim člankom.
Podaci koji podržavaju rezultate ove studije dostupni su u Dodatnim informacijama.Ovaj članak daje originalne podatke.
Chagla, Z. & Madhukar, P. Pojačivači COVID-19 u bogatim zemljama odgodit će vakcine za sve.Chagla, Z. & Madhukar, P. Pojačivači COVID-19 u bogatim zemljama odgodit će vakcine za sve.Chagla, Z. i Madhukar, P. Pojačivači COVID-19 u bogatim zemljama odgodit će vakcine za sve.Chagla, Z. i Madhukar, P. Revakcinacija protiv COVID-19 u bogatim zemljama odgodit će vakcinaciju za sve.Nacionalna medicina.27, 1659–1665 (2021).
Faust, L. et al.Testiranje na SARS-CoV-2 u zemljama sa niskim i srednjim prihodima: dostupnost i pristupačnost u privatnom zdravstvenom sektoru.mikrobna infekcija.22, 511–514 (2020).
Svjetska zdravstvena organizacija.Globalna prevalencija i incidencija odabranih izlječivih spolno prenosivih infekcija: pregled i procjene.Ženeva: WHO, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM et al.Višestruke 2D oblikovane test trake za bočni protok.ASS aplikacija.alma mater.Inter Milano.1, 124–129 (2009).
Schilling, KM i dr.Potpuno zatvoren mikrofluidni uređaj za analizu na papiru.analni otvor.Hemijski.84, 1579–1585 (2012).
Lapenter, N. et al.Kompetitivna imunohromatografija zasnovana na papiru u kombinaciji sa enzimski modifikovanim elektrodama omogućava bežično praćenje i elektrohemijsko određivanje kotinina u urinu.Senzori 21, 1659 (2021).
Zhu, X. et al.Kvantifikacija biomarkera bolesti sa svestranom platformom za tečnost integriranom nanozimima pomoću glukometra.biološki senzor.Bioelektronika.126, 690–696 (2019).
Boo, S. et al.Test traka za trudnoću za detekciju patogenih bakterija pomoću hibridnog nanocvijeća konkavalina A-humanog korionskog gonadotropina-Cu3(PO4)2, magnetske separacije i očitavanja pametnog telefona.Mikroračunar.Časopis.185, 464 (2018).